Перейти к содержимому

Фотография

Разработан новый способ подготовки библиотек микро-РНК

микро-РНК NGS
  • Авторизуйтесь для ответа в теме
В этой теме нет ответов

#1
NCP-eco

NCP-eco

    Завлаб

  • Резидент
  • PipPipPip
  • 1 028 сообщений
 

http://genschool.ru/...otek-mikro-rnk/

Поиск новых генов-мишеней для таргетной терапии заболеваний нередко включает в себя использование микро-РНК в качестве основного инструмента. Авторы данного исследования разработали новый способ подготовки библиотек микро-РНК - RealSeq-AC. Технология включает в себя лигирование микро-РНК с адаптером и последующее замыкание полученного продукта в кольцо. Данный способ позволяет существенно уменьшить негативное влияние «шума» при секвенировании микро-РНК, что открывает возможность для количественного определения микро-РНК, полученной из разнообразных биологических образцов, даже если ее исходное содержание в пробе невелико.

 

inkedmicrorna_li.jpg

 

Для начала напомним, что NGS-библиотека представляет собой совокупность фрагментов исследуемого образца ДНК/РНК одинаковой длины, при этом каждый из фрагментов модифицирован соответствующим для своего метода образом.

Классический способ приготовления NGS-библиотеки РНК включает в себя четыре основные стадии: 1) выделение РНК; 2) фрагментацию РНК; 3) лигирование адаптеров (универсальные «служебные» последовательности для каждого конца молекулы РНК: 3’ и 5’-адаптеры, необходимые для последующей ПЦР); 4) амплификацию при помощи ПЦР. РНК значительно менее стабильна, чем ДНК, поэтому работа с РНК требует особой аккуратности и контроля качества образца на каждом этапе подготовки библиотеки. Для секвенирования образцов РНК на одном из этапов пробоподготовки их переводят в кДНК и далее следуют протоколу, аналогичному тому, что применяется при работе с библиотеками ДНК.

Несмотря на кажущуюся простоту алгоритма анализа, существует огромное количество «подводных камней» и деталей, упущение которых способно привести к некорректному результату. Большинство ошибок анализа, как показывает опыт, закрадывается именно на этапе лигирования адаптеров. Практически все существующие на сегодняшний день протоколы для подготовки библиотек микро-РНК включают в себя схожий способ лигирования двух адаптеров к молекуле микро-РНК.

Авторы работы предлагают альтернативный подход - RealSeq-AC, отличающийся от традиционного двумя важными деталями. Первая деталь заключается в том, что на этапе лигирования 3’-адаптера используется один общий «комбинированный» адаптер, включающий в себя обе стандартные последовательности: 3’ и 5’-адаптеров. Вторая особенность нового подхода состоит в замене этапа лигирования 5’-адаптера стадией циркуляризации, т. е. лигированием полученного фрагмента в ковалентно замкнутое кольцо. В результате полученная кольцевая молекула содержит микро-РНК, окруженную с 3’ и 5’-концов соответствующими адаптерами.

В отличие от стандартных протоколов подготовки библиотек малых РНК, требующих осуществления дополнительной стадии очистки библиотеки для удаления димеров, образованных лигированием 3’ и 5’ адаптеров друг с другом, альтернативная методика не требует дополнительных процедур очистки на геле. Это является большим плюсом предложенного метода, так как при работе с несколькими образцами по стандартному протоколу возникает проблема воспроизводимости результатов ввиду несколько разной степени восстановления целевой фракции РНК после разделении фрагментов на геле. Благодаря использованию «комбинированного» адаптера в методе RealSeq-AC не происходит образование димеров из 3’ и 5’ адаптеров. Это дает возможность избавиться от стадии дополнительной очистки микро-РНК. По словам авторов, если количество исходной микро-РНК составляет более 1 нг, этап очистки полученной микро-РНК на геле уже можно исключить из протокола. Избавляясь от стадии очистки полученной микро-РНК, RealSeq-AC, таким образом, позволяет убрать лишний «шум», снижающий точность количественных экспериментов и препятствующий обнаружению молекул микро-РНК, находящихся в пробе в небольшой концентрации.

Необходимо отметить, что кроме RealSeq-AC существуют и другие методы подготовки РНК-библиотек с использованием одной стадии лигирования адаптера (вместо двух последовательных) и стадии циркуляризации. Однако в описанных методах второй адаптер вводится в составе праймера для обратной транскрипции, таким образом, на стадию циркуляризации поступает уже не РНК, а кДНК. Исследователи отмечают, что эффективность циркуляризации концов РНК гораздо выше, чем ДНК. Таким образом, в методе RealSeq-AC получаются библиотеки, состоящие из РНК, что является дополнительным преимуществом, так как кДНК-библиотеки зачастую содержат примеси укороченных последовательностей кДНК, возникших в ходе обрыва реакции обратной транскрипции, которые впоследствии могут быть ошибочно интерпретированы как особые варианты РНК.

Оригинал статьи

 




Количество пользователей, читающих эту тему: 0

0 пользователей, 0 гостей, 0 анонимных