Перейти к содержимому





Фотография
- - - - -

Комбинированные режимы сортировки: оптимальные условия для каждой сортируемой популяции

Написано BeckmanCoulterLifeSciences , 07 Октябрь 2015 · 1 130 Просмотров

Проточная цитофлуориметрия Цитометрия Сортировка клеток Сортер MoFlo Flow cytometry Cell sorter

Изображение

 

Основным применением современных проточных цитофлуориметров – сортировщиков клеток, кроме полихромного (многоцветного) исследования образцов, является высокоскоростная сортировка целевых популяций клеток с высокой чистотой и жизнеспособностью.

 

Анализ клеток происходит в струе проточной жидкости с выстроенным потоком клеток, которая после облучения лазером, разбивается на капли. Каждая капля содержит одну или несколько клеток, либо не содержит ни одной. Решение о сортировке каждой капли принимается в зависимости от наличия целевых и посторонних клеток в целевой капле, а также в ведущей и замыкающей каплях (см. рисунки 1 и 2). Капля, удовлетворяющая условиям эксперимента, сортируется в заранее выбранную пробирку, лунку планшета или место на стекле.

 

В современных проточных сортировщиках перед каждой сортировкой задается режим сортировки оптимальный для анализируемого образца, выделяемых популяций и стоящих перед исследователем задач. У приборов MoFlo XDP и MoFlo Astrios EQ компании Beckman Coulter три основных режима сортировки, с которыми сочетают еще пять дополнительных режимов (подрежимов). Целью данной заметки является описание этих режимов и подрежимов, их сочетаний, комбинирования в одном эксперименте и описание конкретных примеров их использования в практике. Важно отметить, что уникальной характеристикой сортировщиков компании Beckman Coulter MoFlo XPD и MoFlo Astrios EQ является возможность комбинировать режимы сортировки в ходе одного эксперимента и собирать события, не удовлетворяющие параметрам сортировки в отдельные пробирки с возможностью дальнейшего анализа и сортировки.

 

Основные режимы сортировки MoFlo

  • Режим единичной клетки (Single). Сортируется капля, содержащая только одну целевую клетку. В данном режиме также анализируется содержание ведущей и замыкающей капель. Если хотя бы в одной из них у края со стороны центральной капли находится любая (целевая или посторонняя) клетка, то центральная капля не сортируется. Этот режим обеспечивает высокую чистоту получаемого материала и преимущественно используется при сортировке в планшеты и на стекла.
  • Режим высокой чистоты (Purify). Сортируется капля с одной или несколькими целевыми клетками. Если в капле с целевой клеткой содержится хотя бы одна посторонняя клетка, она не сортируется. Как и в случае режима единичной клетки также анализируется содержание ведущей и замыкающей капель. Если хотя бы в одной из них у края со стороны центральной капли находится посторонняя клетка, то центральная капля не сортируется. Данный режим позволяет достигать высокой чистоты сортировки и большего количества отсортированных событий, чем в предыдущем режиме.
  • Режим обогащения (Enrich). Сортируется любая капля с целевыми клетками, даже если она содержит в себе посторонние клетки. При данном режиме не будет потеряна ни одна целевая клетка. Этот режим необходимо использовать при ограниченном количестве образца. Если необходимо получить более чистую популяцию полученный материал можно подвергнуть повторной сортировке.
Таким образом, основные режимы сортировки приборов серии MoFlo позволяют настроить сортировку по содержанию центральной, ведущей и замыкающей капель. Следующим этапом выбора условий сортировки является задание подрежима, который позволяет определить критерий сортировки по положению целевой клетки в капле.
  • Подрежим ½. Сортируется капля, только если целевая клетка находится в её центре.
  • Подрежим 1. Сортируется капля независимо от положения в ней целевой клетки.
  • Подрежим 1-2. Сортируется одна центральная капля, если целевая клетка находится в ее центре. Или если клетка не находится в центре, то сортируются две капли: центральная с целевой клеткой и ближайшая к этой клетке соседняя капля. Если в капле несколько целевых клеток, которые близко к обеим соседним каплям, то сортируются все три капли.
  • Подрежим 2. Сортируются две капли: центральная и ближайшая к клетке соседняя капля, если в центральной капле одна клетка. Если клеток несколько, и они находятся близко к обеим соседним каплям, то сортируются три капли: центральная и обе соседние капли.
  • Подрежим 3. Всегда сортируются три капли – центральная капля с целевыми клетками, ведущая и замыкающая капли.
Рассмотрим несколько примеров сочетаний основных режимов с подрежимами сортировки, представленных на рисунке 2.
Первый пример Single ½ показывает, что сортируется одна центральная капля и только в том случае, если целевая клетка находится в ее центре. Если клетка смещена к краю капли, она не сортируется. Данное сочетание идеально подходит для суперточной сортировки в планшеты или на стекла. Кроме того, при этом исключается сортировка пустой капли. Режим используется, например, в целях дальнейшего клонирования единичной клетки.
Второй пример Purify 1 показывает, что сортируется одна центральная капля независимо от того, где в ней находятся целевые клетки.
Третий пример Purify 1-2 показывает, что сортируются две капли: одна центральная капля и вторая капля, ближняя к клетке. Оба последних сочетания режимов обеспечивают высокую чистоту сортировки с высокой воспроизводимостью. Четвертый пример Enrich 3 показывает, что сортируются все три капли. Данный режим приводит к быстрому обогащению с сортировкой всех возможных целевых событий.

 

Как уже отмечалось выше, у сортеров серии MoFlo есть уникальная возможность при сортировке в несколько пробирок комбинировать режимы сортировки. Для каждой пробирки можно задать оптимальный для популяции режим сортировки, отличный от режимов для других популяций. Таким образом, каждая популяция сортируется в своем оптимальном режиме!
Кроме того, при комбинированных режимах сортировки открывается еще одна уникальная возможность сбора всех клеток, которые не удовлетворили параметрам сортировки каждой целевой популяций (Abort). При работе на приборах других производителей эти клетки были бы потеряны. Таким образом, можно собрать образец для повторного анализа и сортировки!

 

Необходимо также отметить, что высокая жизнеспособность клеток после выделения в приборах серии MoFlo дает возможность повторной сортировки уже проанализированного образца. Это может быть полезно для получения более высокой чистоты отсортированной популяции или более высокой концентрации целевой популяции, что особенно важно в случае ценного образца или низкой концентрации сортируемых клеток.

 

Рассмотрим пример использования комбинации режимов сортировки при выделении нескольких популяций лимфоцитов и сортировке в шесть пробирок. Данный пример взят из постера «MoFlo Astrios - Multi-Color 6way Sorting, Rare Events, Dendritic cells, Side Population, 11 colour PBMCs (Poster)» (English).
Прикрепленный файл  MoFlo Astrios - Multi-Color 6way Sorting, Rare Events, Dendritic cells, Side Population, 11colour PBMCs (Poster).pdf (17,52МБ)
скачиваний: 183
Рисунок иллюстрирует настройку режимов сортировки для разных популяций, чистоту выделенного материала и эффективность сортировки. Рисунок показывает выбор популяций интереса на гистограммах и результат повторного анализа материала, включая материал, полученный в режиме Aborts.

  • В пробирку в позиции L3 сортировалась популяция клеток CD5+CD19- в режиме единичной клетки (Single) и подрежиме 1/2. Выбор режима обусловлен необходимостью чистой и максимально щадящей сортировки популяции. Данная популяция составила 2,42% от общего количество клеток. Чистота полученного материала 99,18%. Эффективность сортировки 25 % объясняется самым строгим режимом сортировки (Single 1/2), когда значительное количество целевых клеток не сортируются, чтобы полностью исключить загрязнение получаемого материала
  • В пробирку L2 собирались все клетки, не удовлетворяющие параметрам сортировки в пробирку L3.
  • В пробирку L1 выделялась популяция клеток CD4+CD8- в режиме высокой чистоты (Purity) с возможностью сортировки капли, соседней к капле с клеткой интереса (подрежим 1-2). Режим обусловлен необходимостью чистой сортировки, но без потери целевых клеток. Данная популяция составила 3,12% от общего количества клеток. Чистота полученного материала 99,08%. Было отсортировано 70% клеток данной популяции.
  • В пробирку R1 сортировались клетки, не удовлетворяющие параметрам сортировки в предыдущую пробирку.
  • В пробирку R2 сортировались клетки, не удовлетворяющие параметрам сортировки в пробирку R3.
  • В позицию R3 сортировались клетки CD34+ в режиме обогащения (Enrich) с выделением обеих соседних капель (подрежим 3). Выбор режима был обусловлен низкой концентрацией целевых клеток в образце - 0,04 %. Чистота полученного образца 52,04% объясняется самым нестрогим режимом сортировки, при котором в значительном количестве сортировались нецелевые клетки, но была достигнута 100% эффективность выделения редкой популяции CD34+.
Другой пример - сортировка дендритных клеток концентрации 0,11% в 5 мл пробирку со сбором неотсортированного образца в 50 мл пробирку для повторной сортировки на MoFlo Astrios EQ можно посмотреть здесь.
Прикрепленный файл  MoFlo Astrios EQ - Brochure.pdf (11,17МБ)
скачиваний: 283

 

Компания Beckman Coulter рада представить вашему вниманию сортеры клеток MoFlo XDP и MoFlo Astrios EQ. Запишитесь на демонстрацию приборов в Москве, Санкт-Петербурге или Новосибирске прямо сейчас!

 

Для записи на демонстрацию и подробного ознакомления с материалами по данной теме, обращайтесь, пожалуйста, по e-mail lsr-russia@beckman.com или звоните по телефону +7 495 228 6759, +7 495 228 6700

 

Рисунок 1. Слева направо показаны основные режимы сортировки: единичной клетки (Single), высокой чистоты (Purify) и обогащения (Enrich). Внутри капель красная клетка - целевая, синяя – посторонняя. Черным цветом обведены сортируемые события, красным – события, не удовлетворяющие заданным условиям сортировки.
Изображение

 

Рисунок 2. Показаны примеры сочетания основных режимов и подрежимов сортировки при разных положениях целевой клетки в капле.
Изображение

 

Рисунок 3А. Пример комбинации режимов сортировки при шестиструйной сортировке (в шесть пробирок). Показаны чистота полученного материала (Sort Purity) и эффективность сортировки (Sort Efficiency).
Изображение

 

Рисунок 3Б. Назначение целевых популяций для сортировки и анализ сортировки в разных режимах. Выбор популяций интереса (верхний ряд) и результат повторного анализа материала (средний, нижний ряды), включая материал, полученный в режиме Aborts (нижний ряд).
Изображение